Larry Daley (Ben Stiller) deixou o posto de guarda noturno há dois anos, abrindo sua própria empresa. De vez em quando ele volta ao Museu de História Natural, onde trabalhava, para rever os amigos que, à noite, ganham vida. Só que o museu está prestes a passar por uma reforma visando sua modernização, o que fará com que vários dos bonecos de cera sejam substituídos por máquinas que permitem a interação com o público. Eles são enviados ao Instituto Smithsonian, em Washington, o maior complexo de museus do mundo. Um dia Larry recebe um telefonema desesperado de Jedediah (Owen Wilson), o caubói diminuto, pedindo sua ajuda. Larry invade o Smithsonian e descobre que o faraó Kahmunrah (Hank Azaria) despertou, tornando-se uma ameaça não apenas para seus amigos como para o planeta.
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